SPEKTROFOTOMETER

 

       Spektrofotometersesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spectrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang di transmisikan atau yang di absorpsi.

Spektrofotometri merupakan bagian dari fotometri dan dapat dibedakan dari filter fotometri sebagai berikut :

·       Sumber radiasi

Sumber yang biasa digunakan  lampu hidrogen atau deuterium untuk pengukuran UV dan lampu tungsten untuk pengukuran cahaya tampak 

·       Monokromator

Digunakan untuk memperoleh sumber sinar yang monokromatis. Alatnya berupa prisma ataupun  grating. untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diinginkan dari hasil penguraian dapat digunakan celah

·       Sel / Kuvet

Pada pengukuran di daerah sinar tampak kuvet kaca dapat digunakan, tetapi untuk pengukuran pada daerah UV kita harus menggunakan sel kuarsa karena gelas tidak tembus cahaya pada daerah ini. Umumnya tebal kuvetnya adalah 1 cm, tetapi yang lebih kecil ataupun yang lebih besar dapat digunakan.

·       Detektor

Peranan detektor adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang.

Pada umumnya ada beberapa jenis spektrofotometri yang sering digunakan dalam analisis secara kimiawi, antara lain:

a.      Spektrofotometri UV (ultra violet)

b.     Spektrofotometri Vis (visibel)

c.      Spektrofotometer UV-VIS

A. Spektrofotometri Uv

Spektrofotometri UV adalah pengukuran suatu interaksi antara radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Jangkauan panjang gelombang untuk daerah ultraviolet adalah 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan.

Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.

Sinar ultraviolet terbagi menjadi 2 jenis yaitu ultraviolet jauh dan ultraviolet dekat. Ultraviolet jauh memiliki rentang panjang gelombang ± 10-200 nm, sedangkan ultraviolet dekat memilki rentang panjang gelombang ± 200-400 nm. Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri UV adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut tidak berwarna. Senyawa-senyawa organik sebagian besar tidak berwarna sehingga spektrofotometer UV lebih banyak digunakan dalam analisis senyawa organik khususnya dalam penentuan struktur senyawa organik.

Radiasi ultraviolet diabsorpsi oleh molekul organik aromatik, molekul yang mengandung π terkonjugasi dan atau atom yang mengandung elektron –n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari tingkat energi elektron dasar ke tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit yang mengasorpsi sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.

Gugus fungsi yang menyerap radiasi di daerah ultraviolet dekat dan daerah tampak disebut khromofor dan hampir semua khromofor mempunyai ikatan tak jenuh. Pada khromofor jenis ini transisi terjadi dari π   π*, yang meyerap pada λ_maks kecil dari 200 nm (tidak terkonjugasi), misalnya pada >C=C< dan -C≡C-. Khromofor ini merupakan tipe transisi dari sistem yang mengandung elektron π pada orbital molekulnya. Untuk senyawa yang mempunyai sistem konjugasi, perbedaan energi antara keadaan dasar dan keadaan tereksitasi menjadi lebih kecil sehingga penyerapan terjadi pada panjang gelombang yang lebih besar.

Gugus fungsi seperti –OH. –NH2, dan –Cl yang mempunyai elektron-elektron valensi bukan ikatan disebut auksokhrom yang tidak menyerap radiasi pada panjang gelombang lebih besar dari 200 nm, tetapi menyerap kuat pada ultraviolet jauh. Bila suatu auksokhrom mengikat pada suatu khromofor, maka pita serapan khromofor bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang (efek batokhrom) dengan intensitas yang lebih kuat. Efek hipsokhrom adalah suatu pergeseran pita serapan ke panjang gelombang yang lebih pendek yang sering terjadi bila muatan positif dimasukan kedalam molekul dan bila pelarut berubah dari non polar ke pelarut polar.

B. Spektrofotometri Visibel

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak(visible).

Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.

Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memiliki warna. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analit yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan stabil. biasanya pengujian menggunakan reagent pewarna mempunyai waktu maksimal untuk mengukur agar valid. salah satu contoh analisa dengan dtektor Visible adalah Cr6+ yang menggunakan pereaksi 2- diphenil carbazide menghasilkan warna ungu.

C. Spektrofotometri Ultraviolet (UV) Dan Visibel (VIS)

Radiasi elektromagnetik adalah energi yang merambat dalam bentuk gelombang. Sinar ultraviolet (UV) dan sinar tampak (visibel/vis) merupakan contoh radiasi elektromagnetik tersebut. Ada beberapa istilah yang terlebih dahulu harus diketahui sehubungan dengan radiasi elektromagnetik ini, diantaranya panjang gelombang, frekuensi dan energi. Panjang gelombang merupakan jarak linier dari suatu titik pada satu gelombang ke titik yang bersebelahan pada gelombang yang berdekatan.

  Dimensi panjang gelombang dapat dinyatakan dalam berbagai satuan panjang seperti sentimeter (cm), mikrometer (µm), nanometer (nm), dan angstrom (Å).
1 angstrom = 10^{-8 cm}
1 nanometer = 10^{-7 cm}

Satuan nm merupakan satuan yang paling sering digunakan untuk menyatakan panjang gelombang. Lambda (λ) merupakan simbol yang umum digunakan untuk menotasikan panjang gelombang. Sedangkan frekuensi merupakan banyaknya gelombang yang melewati suatu titik tertentu dalam satuan waktu.Hubungan kuantitatif antara energi yang dimiliki oleh suatu radiasi elektromagnetik, frekuensi dan panjang gelombang dapat dituliskan dengan persamaan:
       E = h.v.......................(1)
       v = c/λ.......................(2)
Dari persamaan 1 dan 2 diatas dapat diperoleh persamaan
      E = hc/λ
dimana:
E = energi radiasi
h = tetapan planck (6,626 x 10^-34 joule)
c = kecepatan cahaya yang nilainya 2,998 x 10¹⁰ cms^-1
λ = panjang gelombang
            Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, sedangkan sinar tampak mempunyai penjang gelombang antara 400-750 nm.
Warna sinar tampak dapat dihubungkan dengan panjang gelombangnya. Sinar putih mengandung radiasi pada semua panjang gelombang di daerah sinar tampak. Radiasi monokromatik hanya akan menghasilkan satu sinar tampak.

Penyerapan Radiasi Oleh Molekul

Semua molekul mempunyai energi yang dapat digambarkan menjadi beberapa fenomena. Setiap molekul dapat bergerak:

§  Gerak translasi, yaitu gerakan yang terjadi dimana suatu molekul bergerak secara keseluruhan. Energi yang berhubungan dengan gerak translasi disebut energi translasional (E_trans)

§  Gerak vibrasi, yaitu gerakan dilakukan oleh sebagian dari molekul ( atom atau sekelompok atom). Energi yang berhubungan dengn gerak vibrasi disebut energi vibrasional (E_vib)

§  Molekul dapat berotasi pada sumbunya dan rotasi ini dikarakterisasi dengan energi rotasional (E_rot )

§  Suatu molekul juga memiliki konfigurasi elektronik yang besarnya energi elektronik (E_elek) ini tergantung pada keadaan elektronik molekul.

Energi suatu molekul merupakan hasil penjumlahan dari semua energi tersebut:

   E = E_{trans +} E_vib + E_rot + E_elek

Komponen-komponen energi tersebut dapat dianggap memiliki nilai tertentu dan dikatakan terkuantisasi. Level energi suatu molekul berhubungan erat dengan struktur molekulnya. Hampir tidak 2 molekul yang memiliki energi vibrasional, rotasional dan elektronik yang identik.

Jika suatu molekul bergerak dari suatu tingkat energi  ke tingkat energi yang lebih rendah maka beberapa energi akan dilepaskan. Energi tersebut dapat hilang sebagai radiasi dan dapat dikatakan telah terjadi emisi radiasi. Jika suatu molekul dikenai radiasi elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai sehingga energi molekul tersebut ditingkatkan ke tingkat energi yang lebih tinggi, maka terjadi peristiwa penyerapan (absorpsi) energi oleh molekul. Agar terjadi absorpsi, perbedaan energi antara dua tingkat energi harus setara dengan energi foton yang diserap, atau sesuai persamaan:  

E2 - E1 = hv

dimana:

E1 = Energi pada tingkat yang lebih rendah

E2 = Energi pada tingkat yang lebih tinggi

v   = frekuensi foton yang diabsorpsi

Banyaknya radiasi yang diserap oleh suatu molekul dapat diukur. Grafik yang menghubungkan antara banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi ( atau panjang gelombang) sinar disebut spektrum absorpsi (jamak; spektra). Transisi yang dibolehkan untuk suatu molekul dengan struktur kimia tertentu akan berbeda dari molekul lainnya, sehingga spektrum serapannya juga berbeda. Dengan demikian spektrum serapan molekul ini dapat dijadikan sebagai informasi analisis. Banyaknya sinar yang diabsorpsi sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap radiasi, sehingga spektrum absorpsi dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.

Kromofor merupakan semua gugus atau atom dlaam senyawa organik yang mampu menyearp sinar ultraviolet atau sinat tampak. Kromofor ini ditandai dengan adanya gugus alkena, alkun, karbonil, karboksil, amido, azo, nitro, nitroso dan nitrat. Selain adanya kromofor, pada molekul organik juga dikenal istilah auksokrom yang merupakan gugus fungsional yang mempunya pasangan elektron bebas/elektron menyendiri/elektron yang tak berikatan, seperti: -OH, -O, -NH2 dan lain-lain.

Aspek Kualitatif dan Kuantitatif Spektrofotometri UV-Vis

Spektrum serapan UV-vis dapat digunakan dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif.

A. Aspek Kualitatif

Data spektrum serapan UV-Vis tersendiri tidak dapat digunakan untuk keperluan identifikasi kualitatif suatu molekul obat maupun metabolitnya. Namun bila data tersebut digabungkan dengan metode lainnya seperti spektroskopi infra merah, resonansi magnetik inti, atau spektroskopi massa maka akan dapat digunakan untuk keperluan identifikasi senyawa. Data yang diperoleh dari spektrofotometri UV-Vis adalah:

·       panjang gelombang serapan maksimum

·       intensitas

·       efek pH

·       dan pelarut

dimana data tersebut dapat digunakan dalam analisis dengan membandingkannya dengan data literatur. Dari data spektrum dapat diketahui:

Apakah serapan berubah atau tidak akibat adanya perubahan pH. Lebih lanjut jika perubahan terjadi apakah perubahannya bersifat batokromik, hipsokromik, hipokromik atau hiperkromik.

Apakah molekul bersifat netral (misal; kafein, kloramfenikol) atau mengandung auksokrom (misal; amfetamin, siklizin)

B. Aspek Kuantitatif

Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu satuan luas penampang persatuan waktu. Hubungan kuantitatif spektrum serapan molekul dapat ditulis dengan persamaan:

     A = abc

dimana:

A = absorban

a  = absorptivitas

b  = tebal kuvet (cm)

c  = konsentrasi

Persamaan diatas dikenal dengan hukum Lambert-Beer. Absorptivitas merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada konsentrasi, tebal kuvet, dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel. Absorptivitas tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi.

HukumLambert-Beer berlaku jika:

·       Sinar yang digunakan dianggap monokromatis

·       Penyerapan terjadi pada suatu volume yang mempunyai penampang luas yang sama

·       Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap komponen lain dalam larutan tersebut

·       Tidak terjadi fluoresensi atau fosforisasi

·       Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan

Dalam analisis kuantitatif, spektrofotometri UV-Vis dapat digunakan dalam analisis zat tunggal (satu komponen) atau pun untuk analisis campuran 2 atau lebih zat (multi komponen).

Hal-hal yang Harus Diperhatikan dalam Analisis Spektrofotometri UV-Vis

            Dengan menggunakan spektrofotometri UV-Vis dalam analisis, ada beberapa hal yang harus diperhatikan. Terutama bila analisis dilakukan terhadap zat-zat yang yang tak berwarna dan akan dianalisis dengan menggunakan spektrofotometri visibel, maka zat tersebut terlebih dahulu harus direaksikan menjadi zat yang berwarna.
Pembentukan Molekul yang Dapat Menyerap Sinar UV-Vis
            Pengubahan suatu molekul menjadi molekul lain yang dapat menyerap didaerah UV atau visibel perlu dilakukan terutama bila molekul tersebut tidak menyerap didaerah UV atau visibel. Cara yang dapat digunakan untuk keperluan ini adalah mereaksikan molekul tersebut dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi persyaratan berikut:

·       Reaksinya selektif dan sensitif

·       Reaksinya cepat, kuantitatif dan reprodusibel

·       Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama

Keselektifan suaru pereaksi dapat dinaikan dengan cara melakukan pengaturan pH, pemakaian masking agent, atau penggunaan teknik ekstraksi. Naftil etilen diamin (NED) adalah contoh pereaksi yang sering digunakan untuk mereaksikan obat-obat golongan sulfonamida melalui reaksi diazotasi menghasilkan suatu molekul yang berwarna sehingga dapat dianalisis dengan menggunakan spektrofotometri visibel.

Waktu Operasional

Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan.

Pada saat awal terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna ini meningkat sampai waktu tertentu hingga diperoleh absorbansi yang stabil. Semakin lama waktu pengukuran, maka ada kemungkinan senyawa berwarna tersebut menjadi rusak atau terurai sehingga intensitas warnanya turun akibatnya absorbansinya juga turun. Karena alasan itulah maka pengukuran senyawa berwarna yang dihasilkan dari suatu reaksi harus dilakukan pada saat waktu operasional.

Pemilihan Panjang Gelombang

Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang serapan maksimum. Panjang gelombang serapan maksimum ini dipilih karena:

Pada panjang gelombang serapan maksimum, kepekaannya juga maksimum karena pada panjang gelombang tersebut perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar.

Disekitar panjang gelombang serapan maksimum, bentuk kurva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi

Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang gelombang serapan maksimum.

Pembuatan Kurva Baku

Kurva baku dibuat dari pengukuran satu seri larutan baku zat yang akan dianalisis. Masing-masing larutan baku tersebut kemudian diukur absorbansinya, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan absorbansi (y) dengan konsentrasi (x). Hukum Lambert-Beer terpenuhi bila kurva berbentuk garis lurus.

Klasifikasi sinar tampak beserta warna komplementernya yaitu sebagai berikut :

Panjang gelombang (nm)	Warna	Warna komplementer
400-435	Violet/ungu/lembayung	Hijau kekuningan
435-480	Biru	Kuning
480-490	Biru kehijauan	Jingga
490-500	Hijau kebiruan	Merah
500-560	Hijau	Ungu kebiruan
560-580	Hijau kekuningan	Ungu
580-610	Jingga	Biru kehijauan
610-680	Merah	Hijau kebiruan
680-800	Ungu kemerah-merahan	Hijau